第四章（六）食品中维生素检验

先建立整体认识

维生素测定与前面几个单元有一个根本区别：被测物含量极低、稳定性极差。

含量低到每 100 g 食品里只有微克到毫克级，所以方法几乎全靠仪器——HPLC、荧光分光光度、紫外分光光度；稳定性差到见光、遇氧、遇热、遇酸碱都可能分解，所以前处理的每一步都在跟“损失”较劲：皂化要加抗氧化剂、提取要避光、标准液要临用前标定、测定要快。

这两条决定了本章的方法结构：先用一种物理化学手段把维生素从基质里“拿出来并保住”（皂化、提取、净化），再用一种对它敏感的手段“测出来”（荧光、紫外、折光）。理解了这个“保住—测出”的框架，十几种维生素的具体方法就不必逐个死记——它们的差别主要在化学性质（脂溶还是水溶、耐酸还是耐碱、怕光还是怕氧）与前处理条件上。

在课程里的位置：第四章七个单元的第六个，也是方法最多、参数最密的一个。它是前面水分、蛋白质、脂肪、碳水化合物四章的“仪器化版本”，前面靠称量和滴定，这里靠色谱与荧光。

核心内容

概述：定义与三条意义　对应学习目标：了解

第 5 页把维生素定义为“人体几乎不能合成，调节机体生理功能所必需的一类低分子有机化合物”，并给了三条测定意义：了解各种食物中维生素的种类和含量，评价食物营养价值、指导合理膳食；研究食品加工、贮存过程中维生素的变化，以制定合理的加工工艺与贮存条件；对富含维生素食品的开发、维生素强化及营养标签制作有重要参考价值。

三条意义的共同点是“变化”——维生素测定的价值不只在测得一个数，更在比较加工前后、贮存前后的差。这一档点到为止，维生素的分类、生理功能、缺乏症课件没有展开，正文不代拟。

脂溶性与水溶性：一张表定下方法地图　对应学习目标：掌握

第 6 页用一张三列的表（名称、亚组、国家标准分析方法）把维生素分成两大组，逐行给出对应的标准方法。这张表是全章的地图，读法是“按行读维生素，按列看方法”：

组	维生素	国家标准分析方法
脂溶性	维生素 A	HPLC、三氯化锑分光光度法
脂溶性	胡萝卜素（维生素 A 原）	HPLC、纸层析法
脂溶性	维生素 D	HPLC
脂溶性	维生素 E	HPLC
脂溶性	维生素 K	HPLC
水溶性	维生素 B1（硫胺素）	荧光分光光度法、HPLC
水溶性	维生素 B2（核黄素）	荧光分光光度法、HPLC、微生物法
水溶性	维生素 B3（烟酸）	微生物法（GB/T 5009.89）、分光光度法（GB/T 9695.25）、HPLC（GB 5413.15）
水溶性	维生素 B5（泛酸）	微生物法
水溶性	维生素 B6（吡哆素）	荧光分光光度法、HPLC（GB 5413.13）、微生物法（GB/T 5009.154）
水溶性	维生素 B7（生物素）	微生物法
水溶性	维生素 B11（叶酸）	微生物法
水溶性	维生素 B12（钴胺素）	微生物法（GB 5413.14）、HPLC（5009.217）
水溶性	维生素 C	荧光分光光度法、苯肼分光光度法、2,6-二氯靛酚滴定法

（第 6 页表格，已按 260 dpi 渲染逐行核对。纯文本抽取会把“维生素”列与方法列串行，必须以渲染结果为准）

表里的规律很清楚：脂溶性五种全部首选 HPLC；水溶性里 B 族多数首选荧光分光光度法或微生物法，C 有三种并列方法。这条规律背后是化学性质——脂溶性维生素极性小、可用反相色谱分离；水溶性 B 族多数有天然荧光或能被氧化成有荧光的物质；微生物法靠菌株对特定维生素的生长需求，适合 B 族中含量极低、又缺少专一化学反应的品种。

课件的正文只展开了 VA/VE、胡萝卜素、VD、VK、VB1、VB2、VC 七组，其余 B 族只在这张表里出现。本章正文照此比例写。

VA 与 VE 同时测定：先皂化，再上柱　对应学习目标：掌握

第 8 页先给两者的化学性质差别：维生素 A1（视黄醇）含 β-紫罗酮环，对氧和光线较为敏感，对酸不稳定、对碱较稳定，耐热性较好，有抗氧化剂存在时可以经受煮沸；α-生育酚（VE）含苯并二氢呋喃环，对碱和氧不稳定，对酸和热较为稳定，除油炸外一般烹调损失不大。

一耐碱、一怕碱，两者却要一起测，解决办法是“皂化”——第 9 页的流程是：样品加无水乙醇、抗氧化剂 VC、内标物苯并[a]芘、KOH（1:1），回流皂化；用乙醚提取，乙醚层经无水硫酸钠脱水；55 ℃ 水浴中减压蒸馏浓缩后氮气吹干；用乙醇定量，离心，上清液供色谱分析。

每个添加物都有明确任务。加 KOH 是为了把样品中的脂肪皂化掉（甘油三酯变脂肪酸盐），否则大量脂肪会污染色谱柱；加 VC 是抗氧化剂，保护易氧化的 VA 与 VE；加苯并[a]芘是内标，用来校正提取与进样过程中的损失；用乙醚提取是因为皂化后 VA、VE 仍留在有机相；无水硫酸钠脱水是防止水分进入色谱系统；55 ℃ 减压浓缩与氮气吹干是为了在低温、无氧条件下把溶剂赶掉，避免维生素在浓缩这一步被破坏。

第 9 页的原理说明：用高效液相色谱 C18 反相柱将维生素 A 和 E 分离，经紫外检测器检测，以保留时间定性、内标法定量。

第 10 页给了四条使用要点：最小检出限为 VA 0.8 ng、α-生育酚 91.8 ng、γ-生育酚 36.6 ng、δ-生育酚 20.6 ng；VA 和 VE 的标准溶液临用时需用紫外分光光度法标定浓度，实验操作应避光、采用棕色玻璃器皿；本法不能分开 β-生育酚和 γ-生育酚，故 γ-生育酚峰中含有 β-生育酚峰。

第三点很重要：这是方法的固有局限，不是操作失误。报“γ-生育酚”的结果时，实际包含了 β-生育酚，写报告时应注明。

四个检出限的量级差别也值得注意：VA 0.8 ng 与 α-生育酚 91.8 ng 差了两个数量级，说明同一套条件下各同系物的响应差异很大，不能用一个检出限代表全部。

胡萝卜素：450 nm 的吸收与 6∶1 的效价　对应学习目标：掌握

第 11 页讲类胡萝卜素（Carotenoids），包括 α、β、γ-胡萝卜素、玉米黄素、番茄红素。其中 α、β、γ-胡萝卜素与玉米黄素在分子结构中含有 β-紫罗宁残基，在肝脏、小肠粘膜或其他组织中可转化为维生素 A，故称维生素 A 原；β-胡萝卜素的效价最高，6 µg β-胡萝卜素相当于 1 µg 维生素 A。

化学性质上，胡萝卜素对热、酸和碱比较稳定，但紫外线和氧可促进其氧化破坏；在 450 nm 波长处有最大吸收。这两个性质分别决定了操作与检测：避光、避氧是操作要求，450 nm 是分光光度检测的依据。

方法列了三种：HPLC（GB/T 5009.83）、纸层析法（GB/T 5009.83）、薄层色谱法。HPLC 的原理是：用丙酮和石油醚（20+80）混合液提取，经三氧化二铝柱纯化，采用高效液相色谱法以 C18 柱分离，紫外检测器检测，以保留时间定性、峰面积定量。

第 12 页给了四条说明：最低检出限 5.0 mg/kg(L)，线性范围 0～100 mg/L；层析柱中所装的三氧化二铝需预先于 140 ℃ 活化 2 h，取出放入干燥器备用；用丙酮-石油醚提取 β-胡萝卜素时，若样品含水量较多，适当增加丙酮的比例可提高提取效率。

“含水多就多加丙酮”是一条实用经验：丙酮与水互溶，能帮助溶剂渗入含水基质；石油醚负责溶解胡萝卜素。两者的比例随样品水分调整，这也是为什么课件写“20+80”而不是固定比例。

纸色谱法的原理也给了：样品经皂化后用石油醚提取胡萝卜素及其他植物色素，以石油醚为展开剂进行纸色谱分离；由于胡萝卜素极性小、移动速度快，与其他色素分离，剪下含胡萝卜素的色带后洗脱测定。

维生素 D：正相净化加反相分离　对应学习目标：掌握

第 13 页给化学性质：稳定，在中性和碱性溶液中耐热，不易被氧化，在酸性条件下会逐渐分解；分为 VD2（麦角钙化醇）与 VD3（胆钙化醇）；方法为 HPLC（GB 5413.9）与紫外-可见分光光度法。

第 14 页的原理是：样品皂化后经石油醚提取，维生素 D 用正相色谱法净化、反相色谱法分离，根据保留时间定性、标准曲线定量。三条说明：适用于婴幼儿食品和乳品中 VD 的测定；可不经正相色谱净化同时测定，方法检出限为 VA 1.00 µg/100 g、VE 10.00 µg/100 g、VD 0.20 µg/100 g；HPLC 测定 VD 需要同时做加标回收率实验，校正实验测定结果。

“正相净化 + 反相分离”是本章唯一出现两级色谱的维生素。正相用极性固定相、非极性流动相，适合把 VD 与大量脂类杂质分开；反相用非极性固定相、极性流动相，适合定量。两步串起来，代价是时间长，收益是干扰少。

“要做加标回收”这一条是针对 VD 的特殊要求：VD 在食品中含量低、又容易在皂化与净化中损失，不做回收就无法判断结果偏低了多少。这一点与 VA/VE 用内标法解决损失问题形成对照——一个用内标校正，一个用回收率校正。

维生素 K：248 nm 与避光　对应学习目标：掌握

第 15 页：VK 分叶绿醌类（VK1，凝血维生素）、甲基萘醌类（VK2）与人工合成的 VK3；化学性质为稳定、耐酸、耐热，但易被碱和紫外线分解；方法有 HPLC、紫外分光光度法、GC；标准依据 GB/T 5009.158（蔬菜）、GB 5413.10（婴幼儿食品和乳品）。

第 16 页给 HPLC 原理：样品中 VK1 经石油醚提取后，用氧化铝色谱柱净化，收集样液，浓缩定容后用 C18 柱分离，在 248 nm 处用紫外检测器检测，标准曲线法定量。三条说明：适用于各类蔬菜、绿色植物及干制品中 VK1 的测定；最低检出限 0.5 µg，线性范围 1～100 µg/mL；VK1 易在紫外线照射下分解，所有操作均需避光进行。

“耐酸、耐热但怕碱和紫外线”这一组性质直接决定了操作：不用碱（避免用皂化，与 VA/VE 相反）、全程避光（棕色器皿、暗室操作）。同一章里两个脂溶性方法对“碱”的态度相反，是本章最容易混的一处。

维生素 B1：氧化成硫色素再测荧光　对应学习目标：掌握

第 18 页：VB1 又称抗脚气病维生素、抗神经炎维生素；易溶于水和正丁醇、异丁醇等有机溶剂，微溶于乙醇；酸性条件下较稳定，较耐热且不易被氧化；中性和碱性环境中易被氧化破坏，生成硫色素。方法有硫色素荧光法（GB/T 5009.84）、HPLC（GB 5413.11、GB/T 9695.27，适用于婴幼儿食品及乳品、肉及肉制品）、紫外分光光度法。

第 19 页给荧光分光光度法的原理：硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成硫色素，硫色素在紫外线照射下发射荧光（激发波长 365 nm、发射波长 435 nm），在一定条件下荧光强度与硫色素浓度成正比，即与溶液中硫胺素含量成正比。

页面上把反应画成“硫胺素 →（-2H·HCl）→ 硫色素”，并在下方用一条绿色条带标出“提取→净化→氧化”三步。这三步的顺序不能颠倒：先把硫胺素从基质中提出来，再净化去掉干扰荧光物质，最后才氧化成硫色素。若先氧化再净化，硫色素会在净化过程中损失或分解。

三条说明：最低检出限 0.05 µg，线性范围 0.2～10 µg/mL；为使结合态硫胺素变为游离态以利于测定，需对样品进行酸水解和酶水解；紫外线会破坏硫色素，测定需避光、快速。

“酸水解 + 酶水解”两步针对的是结合态：食品中的硫胺素常与蛋白质结合（如焦磷酸硫胺素），不水解就测不出全量。这是本章“前处理决定结果”最典型的例子。

维生素 B2：荧光强度差减法　对应学习目标：掌握

第 20 页：VB2 微溶于水，对空气、热稳定，在中性和酸性溶液中不易被破坏，但在碱性溶液中较易分解；对光敏感，易被紫外线破坏，在碱性溶液中光线照射可产生有较强荧光的光黄素。方法有荧光法（GB/T 5009.85）、HPLC（GB 5413.12、GB/T 9695.28）、微生物法（GB/T 5009.85）。

第 21 页的原理有一个巧妙设计：核黄素在 440～500 nm 波长光照射下产生黄绿色荧光，稀溶液中荧光强度与含量成正比；在 525 nm 波长下测定样品的荧光强度后，加入低亚硫酸钠（连二亚硫酸钠）把核黄素还原为无荧光的物质，再测一次，两者之差即为核黄素本身的荧光强度。

这个“加还原剂前后各测一次、相减”的做法，解决的是“样品中其他物质也在发荧光”的问题——第一次测的是“核黄素 + 杂质”的总荧光，第二次测的是“杂质”的荧光，相减就只剩下核黄素。

三条说明：最低检出限 0.006 µg，线性范围 0.1～20 µg；核黄素对可见或紫外光极不稳定，实验应在避光条件下进行；核黄素被低亚硫酸钠还原为无荧光物质后，摇动后很快又被氧化成荧光物质，所以要立即测定。

第三条是操作上的硬约束：还原是暂时的，测完必须马上完成第二次读数，否则差值失真。

维生素 C：两类指标、四条路线　对应学习目标：掌握

第 22 页先区分两个概念：抗坏血酸有生理活性，其氧化产物脱氢抗坏血酸无生理功能（但在体内可部分还原）；抗坏血酸是强还原剂，酸性稳定，中性和碱性不稳定，受热、遇氧易破坏。方法列了四条：荧光分光光度法（GB/T 5009.86、GB/T 9695.29、GB 5413.18）、2,6-二氯靛酚滴定法（GB 6195）、固蓝盐比色法（GB 5009.159）、分光光度法与滴定法与 HPLC。

VC 的测定分两个指标，方法也不同。

**总抗坏血酸（第 23—24 页）**有两条路线。荧光法：还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与邻苯二胺生成有荧光的喹喔啉衍生物，荧光强度与浓度在一定条件下成正比。2,4-二硝基苯肼法：还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与 2,4-二硝基苯肼作用生成红色脎，颜色强度与总抗坏血酸含量成正比，测吸光度定量；检出限 0.1 µg/mL，线性范围 1～12 µg/mL；需避光；硫脲防止抗坏血酸氧化、利于脎形成，但硫脲在溶液中的最终浓度应一致，否则影响结果；从冰水中取出 30 min 后立即测定，否则溶液颜色加深。

**还原型抗坏血酸（第 25 页）**用 2,6-二氯靛酚法：染料在中性或碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色，被还原后颜色消失；滴定时还原型抗坏血酸把染料还原为无色，本身被氧化为脱氢抗坏血酸，终点时稍过量的染料使溶液呈微红色。三条操作要求：用偏磷酸-乙酸提取抗坏血酸；染料需现配并用已知浓度的抗坏血酸标准溶液标定；微红色 15 秒不消失为终点。

两条路线的分工很清楚：测“总量”用荧光法或 2,4-二硝基苯肼法（先把还原型氧化成脱氢型，让所有 VC 都进入同一化学形态）；测“还原型”用 2,6-二氯靛酚法（只与还原型反应）。同一份样品两个数之差，就是已氧化的那部分。

图表与结果怎么看

维生素—方法对照表（第 6 页）。 十四行的三列表，左侧“名称”列用合并单元格把脂溶性与水溶性分成两大块，中间“亚组”列逐个列维生素，右侧“国家标准分析方法”列给方法。读法是先定组、再定行：同一组内的维生素方法相近，跨组则完全不同。观察重点是 B3、B6、B12 三行的方法后面带标准号，而其他行不带——带标准号的是课件特意标出的，答题时能写上是加分项。

硫色素反应与流程（第 19 页）。 页面中间是“硫胺素 →（-2H·HCl）→ 硫色素”的结构式变化，箭头上的”-2H·HCl“表示脱去两个氢并成盐；下方绿色条带写”提取→净化→氧化”，是操作顺序；左侧配了荧光分光光度计照片与标准品实物，右下角是一张三维荧光光谱图。观察重点是箭头上的化学变化与下方流程的先后关系——化学上是“氧化”，操作上是“最后一步才氧化”。

本章的图只有上面两处（第 6 页对照表、第 19 页反应式），没有标准曲线图与装置图；VA/VE、VD、VK、VB1、VB2、VC 的仪器参数（色谱柱、流动相、波长）都以文字给出，读数时直接看数字，不存在坐标轴问题。

易混点

脂溶性 vs 水溶性。 不只是溶解性差别，还决定方法路线：脂溶性几乎全走 HPLC，水溶性多用荧光或微生物法（第 6 页）。

VA/VE 要皂化，VK 不能遇碱。 同一章里两个脂溶性方法对碱的态度相反，原因是 VA/VE 需要皂化去掉脂肪，而 VK 易被碱分解（第 9、15 页）。

内标法 vs 加标回收。 VA/VE 用苯并[a]芘作内标校正损失；VD 要求做加标回收率校正结果。两者都在解决“损失”，手段不同（第 9、14 页）。

“β-与 γ-生育酚分不开”是方法局限。 报 γ-生育酚时实际含 β-生育酚，不是操作失误（第 10 页）。

6 µg β-胡萝卜素 = 1 µg 维生素 A。 这是效价折算，不是质量相等（第 11 页）。

VB1 要“先提取净化、最后氧化”，VB2 要“测两次相减”。 前者防硫色素在净化中损失，后者扣除杂质荧光（第 19、21 页）。

总抗坏血酸 vs 还原型抗坏血酸。 前者先把还原型氧化成脱氢型再测总量，后者只测还原型；两者之差是已氧化的部分（第 23—25 页）。

“避光”在这章出现多次，原因不同。 VA/VE 怕光氧化、VK 怕紫外线分解、VB1 的硫色素怕紫外线、VB2 怕光生成光黄素、VC 怕光加速氧化——同一要求，五种机理（第 9、10、16、19、21 页）。

常见考试问法

第 26 页“小结与思考题”共八题，全部收录：

1. 测定食物中维生素含量的重要意义。（第 26 页）
2. HPLC 法同时测定维生素 A 和维生素 E 的原理及注意事项。（第 26 页）
3. HPLC 法测定维生素 D 的原理及注意事项。（第 26 页）
4. HPLC 法测定维生素 K1 的原理及注意事项。（第 26 页）
5. 荧光分光光度法测定硫胺素的原理及注意事项。（第 26 页）
6. 荧光分光光度法测定核黄素的原理及注意事项。（第 26 页）
7. 荧光法和 2,4-二硝基苯肼法测定总抗坏血酸的原理及注意事项。（第 26 页）
8. 2,6-二氯靛酚法测定还原型抗坏血酸的原理。（第 26 页）

按本章掌握点还可以设：

9. VA 与 VE 同时测定时，为什么要加 VC、苯并[a]芘与 KOH？（第 9 页）
10. 胡萝卜素的 HPLC 测定中，样品含水量高时为什么要增加丙酮比例？（第 12 页）
11. 核黄素荧光法为什么要加低亚硫酸钠测第二次？（第 21 页）
12. 硫胺素测定为什么需要酸水解和酶水解？（第 19 页）

必须能回答的问题

• 为什么脂溶性维生素几乎都用 HPLC，而 B 族多用荧光或微生物法？
• 皂化在 VA/VE 测定里起什么作用？为什么 VK 不能皂化？
• 内标法与加标回收，各自解决什么问题？为什么 VD 必须做回收？
• 核黄素“测两次相减”扣掉的是什么？
• 硫胺素为什么一定要在净化之后才氧化？
• 总抗坏血酸与还原型抗坏血酸，两条路线的分岔在哪一步？
• 本章出现的五次“避光”，分别防的是什么？

来源

课件

• 《第4章 食品的营养成分检验6 食品中维生素检验.pdf》27 页。使用页：第 4 页（学习要求）、第 5 页（定义与三条意义）、第 6 页（维生素—方法对照表，已按 260 dpi 渲染核对）、第 7 页（脂溶性维生素的三条性质线索）、第 8 页（VA 与 VE 的化学性质）、第 9 页（VA/VE 同时测定的原理与流程）、第 10 页（四条检出限与注意事项）、第 11 页（胡萝卜素、VA 原、6∶1 效价、450 nm）、第 12 页（胡萝卜素 HPLC 原理与四条说明、纸色谱原理）、第 13 页（VD 化学性质与两种方法）、第 14 页（VD 的 HPLC 原理与三条说明）、第 15 页（VK 分类、性质、标准依据）、第 16 页（VK1 的 HPLC 原理与三条说明）、第 17 页（水溶性维生素的三条性质线索）、第 18 页（VB1 性质与方法）、第 19 页（硫色素荧光法原理、反应式与三条说明）、第 20 页（VB2 性质与方法）、第 21 页（核黄素荧光法原理与三条说明）、第 22 页（VC 两个指标与四条路线）、第 23 页（总抗坏血酸荧光法原理）、第 24 页（2,4-二硝基苯肼法原理与四条说明）、第 25 页（2,6-二氯靛酚法原理与三条要求）、第 26 页（思考题）。

官方标准

• 课件给出的标准号：GB/T 5009.83（胡萝卜素）、GB 5413.9（VD）、GB/T 5009.158（蔬菜中 VK1）、GB 5413.10（婴幼儿食品和乳品中 VK）、GB/T 5009.84（VB1）、GB 5413.11 与 GB/T 9695.27（VB1 的 HPLC）、GB/T 5009.85（VB2）、GB 5413.12 与 GB/T 9695.28（VB2 的 HPLC）、GB/T 5009.86 与 GB/T 9695.29 与 GB 5413.18（VC）、GB 6195（2,6-二氯靛酚滴定）、GB 5009.159（固蓝盐比色）、GB/T 5009.89、GB/T 9695.25、GB 5413.15、GB/T 5009.154、GB 5413.14、5009.217（B 族）。均未给条款，本轮未核对现行版本。

教材

• 未获得。正文无教材页码。

外部资料

• 未使用。所有检出限、波长、线性范围均取自课件原页，未凭记忆补写。

理解性补充

• “保住—测出”的框架性归纳；
• 皂化、抗氧化剂、内标三者在 VA/VE 流程中各自的角色；
• “正相净化 + 反相分离”两级色谱的分工；
• VB1”三步顺序不能颠倒“的理由；
• 核黄素差减法的原理；
• 五次“避光”对应五种机理的归纳。

待核实问题

1. 第 6 页表格中 B 族部分行的方法后带标准号、部分不带，课件未说明取舍标准；正文照表录入，未补号。
2. 第 7、17 页只列了“溶解性、耐酸碱性、耐热性、耐氧化性”四个词作为线索，未展开，正文未代拟具体性质。
3. 第 14 页“可不经正相色谱净化同时测定”的检出限（VA 1.00、VE 10.00、VD 0.20 µg/100 g）与第 10 页单测 VA/VE 的 ng 级检出限单位不同，两者不可直接比较，正文未换算。
4. 第 19 页反应式写作”-2H·HCl”，其化学计量含义（脱氢并成盐酸盐）为编者解读，课件只给符号。
5. 第 11 页“6 µg β-胡萝卜素相当于 1 µg 维生素 A”是课件给的折算，未标注标准出处。
6. 各标准号的现行版本未核；课件未给任何标准的条款号与年限（除 5009.217 未写 GB 前缀）。
7. VA/VE、VD、VK、VB1、VB2 的色谱柱型号与流动相，除 VD 与 VK 部分给出外，多数未给，正文未补。